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同时检测LDH释放及活细胞（MTT、CCK-8等方法）的文献数量变化

（本数据由同仁化学研究所调查）

方法	MTT法	CCK-8法	LDH法
产品	MTT	CCK-8（CK04）	Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST^®(CK12)
检测对象	活细胞	活细胞	死细胞
检测结果	细胞存活率	细胞存活率	细胞死亡(损伤)率
用途	细胞增殖毒性	细胞增殖毒性	细胞毒性、细胞损伤
底物	MTT	WST^®-8	WST^®
底物作用对象	线粒体内脱氢酶	细胞内脱氢酶	乳酸脱氢酶（LDH）
检测方法	比色法	比色法	比色法
Formazan水溶性	不溶于水	溶于水	溶于水
优点	成本低	重现性好	无需使用放射性同位素⁵¹Cr
		灵敏度高	适合做效靶细胞实验
		操作简便	适合做ADCC、CART实验
		试剂稳定性高	试剂稳定性高
		对细胞毒性小	对细胞毒性小
		Formazan溶于水
		适合高通量筛选
缺点	Formazan不溶于水，需用有机溶剂溶解	CCK-8试剂和酚红颜色接近，有时会有漏加或多加的情况	血清浓度高时会有干扰
	对细胞有毒性		灵敏度比放射性同位素⁵¹Cr低
	操作繁琐，增加误差
	不适合悬浮细胞
	试剂需现配现用
产品性状	粉末	液体	液体、冻干粉

MTT法检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan），而死细胞无此功能。用DMSO溶解甲臜后在490nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

Cell Counting Kit-8(CCK-8)法原理：CCK-8中的主要成分WST^®-8能被细胞内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲臜，生成甲臜的量与细胞数成正比，可间接测定活细胞数量。
乳酸脱氢酶(LDH)法检测原理：乳酸脱氢酶(LDH)是存在于细胞质的一种酶，当细胞膜受到损伤时，LDH 会释放到培养基中。由于释放出的LDH 稳定，检测培养基中LDH 的量可以作为测定死细胞和受损细胞数量的指标。Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST^®可以测定受损细胞所释放出的LDH，其原理是LDH 催化乳酸生成丙酮酸和NADH，NADH 通过电子载体可将水溶性四唑盐WST^®（无色）还原成甲臜产物（橙色），WST^®甲臜产物的吸光度与LDH 的量呈正比，利用此原理可以测定死细胞和受损细胞的数量。

MTT法和CCK-8法反映的是细胞的存活率，虽然也可以间接反映细胞毒性，但当外在因素改变(线粒体)脱氢酶活性时，有时结果就会出现偏差。这时最好的方法是同时测定LDH的释放来验证细胞的损伤率，用2种方法来相互验证会使结果更可靠，更有说服力。
在体外细胞损伤模型实验中，往往需要同时检测多种指标来验证，例如：细胞存活率（MTT法或CCK-8法）、细胞凋亡（Annexin V-FITC）、细胞损伤（LDH法）、ROS、SOD、GSH、MDA、线粒体膜电位等指标。有关详细内容请参见体外细胞损伤模型的检测指标。

【相关产品】

〇 Cell Counting Kit-8（货号：CK04）

〇 Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST^®（货号：CK12）

〇 MTT

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使用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST^®的细胞损伤实验

　　1960年Nachlas等进行了以乳酸脱氢酶(LDH)的释放为指标的细胞损伤实验后，以检测LDH作为一种确认细胞状态方法的相关文献在全球的数量越来越多（图1）。本次例举4篇近年发表过的文献，均通过检测LDH的释放确定细胞损伤率。

　　Watanabe等研究水通道蛋白（AQP，膜蛋白质）的机理及与疾病的关联¹⁾。已知AQP与细胞内水的转运有关，近年的研究表明，AQP也会透过甘油、H₂O₂等小分子，甚至对细胞增殖及迁移产生影响。Watanabe等为证实AQP-9对H₂O₂转运的影响，通过利用siRNA得到AQP-9基因沉默的HepG2细胞及H₂O₂荧光探针(CM-H2DCFDA)进行细胞对外源性H₂O₂的抑制实验。实验中，利用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST^®检测LDH的释放并确定由抑制H₂O₂转运引起的细胞伤率。结果，对照组正常细胞进行H₂O₂转运并检测到CM-H2DCFDA荧光，同时检测出LDH释放确认细胞受损。实验组细胞敲除AQP-9，细胞内没有检测出H₂O₂，并通过测定LDH的释放确认没有发生细胞损伤（图2）。

图2 检测AQP-9敲除的细胞内H₂O₂及LDH的释放

　　Shu-fang Jin等研究突发性肺纤维化治疗药Pirfenidone（图3）的作用机能，其中合用Cell Counting Kit-8(CCK-8)和Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST^®进行评价²⁾。结果Pirfenidone对老鼠纤维芽细胞C3H10T1/2的增殖及纤维化有一定抑制并能够增强激酶抑制剂XL413的效果，利用CCK-8检测XL413加入前后，Pirfenidone对细胞增殖的抑制率，结合Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST^®确认细胞的增殖抑制并非由XL413本身引起。

图3 Pirfenidone及XL413的结构式

　　此外，Liping Wu等研究弱酸刺激人上皮细胞(HEECs)ATP的释放，同时确认有无LDH释放增加³⁾。Wakatsuki等使用6-hydroxydopamine对原代神经细胞诱导凋亡后，以caspase3、Annexin V及LDH为指标进行测定⁴⁾。对于细胞损伤而言，通过检测几种不同原理的指标进行实验结果的相互验证。同仁化学研究所生产并销售各类细胞增殖、毒性、损伤检测试剂盒及细胞染色等试剂，旨在以此帮助实验者阐明细胞内各类机理。

【相关产品】

〇 Cell Counting Kit-8（货号：CK04）

〇 Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST（货号：CK12）

〇 Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit（货号：AD10）

〇 MTT

《参考文献》

1) S. Watanabe, et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 2016, 471, 191.

2) S. Jin, et al., Exp. Cell. Res., 2015, 339, 289.3) L. Wu, et al., Am. J. Physiol. Gastroinest. Liver Physiol., 2015, 309, G695.

4) S. Wakatsuki, et al., J. Cell. Biol., 2015, 211, 881.

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三种常用的细胞增殖、毒性检测方法的原理、特点与比较-日本东仁化学